2024年6月18日上午，动物消化道营养国际联合研究中心第171期消化道营养精品学术沙龙在逸夫楼2064顺利举办。本期的学术沙龙由消化道微生物实验室的硕士生刘晓英、张凯和博士生张宇、尹的做文献汇报，动物消化道营养国际联合研究中心的老师学生参与此次沙龙。特选张凯同学的精彩汇报进行展示。

硕士生张凯对文献《A Dietary Fiber-Deprived Gut Microbiota Degrades the Colonic Mucus Barrier and Enhances Pathogen Susceptibility》-《膳食纤维的缺乏肠道菌群降解结肠粘液屏障并增强病原体易感性》进行了汇报。

膳食纤维具有多种益生功能，世界卫生组织推荐每人每天摄入量在28-35g。充足的膳食纤维已被表明有利于缓解和预防便秘，增加肠道益生菌，预防肠道疾病，癌症等。而当前大部分居民，特别是发达国家居民，每日纤维摄入量是严重不足的。柳叶刀上的研究表明，这种纤维缺乏是与多种疾病相关的，其中主要是肠道疾病。正常情况下，肠道微生物主要以宿主无法降解的膳食纤维为食，并为肠道上皮细胞提供短链脂肪酸，维持肠道稳态。然而在纤维缺乏日粮模式下微生物是如何满足其能量需要维持生存的呢？肠道内除了纤维多糖外，还存在一层起防御作用的粘液多糖，主要由MUC2蛋白组成，其中百分之80%以上是由0-聚糖结构，微生物也是可以降解的，已有研究表明，MUC-2和O-糖基化结构的减少与多种肠道炎症相关。此外作为宿主防御有害微生物的第一道屏障，治病菌要想诱发疾病，首先需要攻破粘液屏障。基于此，作者做出了科学假设：纤维缺乏的肠道微生物会觅食粘液多糖，维持生存，导致致病菌更容易感染，增加肠道炎症。

作者利用培养组学的方法设计了合成微生物群，其中包括5株拟杆菌门微生物，5株厚壁菌门微生物，1株阿克曼氏菌，1株疣微菌，2株变形菌。此外作者利用42种植物和动物来源的单糖和多糖对这14种微生物进行了体外生长试验。这些生长试验能够帮助确定膳食纤维和宿主粘膜多糖的主要成分被合成微生物群中的哪种或哪些菌株利用。可以看到这些微生物可以很好的代谢纤维多糖，在生理和生态上能够一定程度代表更复杂的原生肠道微生物群。此外只吞噬粘液O-聚糖的有粘液阿克曼氏菌，肠道巴恩斯氏菌；既能降解纤维又能吞噬粘液多糖的有多形拟杆菌和粪便拟杆菌。只有四株能够降解粘液多糖，整体上并没为偏向于降解粘液多糖。在此基础上作者进行了无菌小鼠的灌服试验和日粮干扰试验，首先作者在无菌小鼠上进行连续14天的微生物灌服，期间进行qPCR确认微生物定植了成功，此外作者预试验证明了无论鼠笼，小鼠性别，实验重复量及分析方法如何，小鼠都能表现出可重复性的微生物稳定定植。作者使用了三种日粮，纤维日粮含15%最低限度加工的植物纤维多糖；无纤维日粮淀粉和麦芽糖被葡萄糖替代，益生元日粮是在FF日粮基础上添加了纯化的可溶性糖。饲喂前都进行灭菌处理。其中FR和FF模拟两种极端饮食结构，Pre模拟日类吃益生元，日粮交替模拟人类饮食结构变化。

粪便微生物16S结果表明，当日粮从FR切换到FF后，一些微生物含量出现了明显快速的变化；其中能降解粘蛋白O-聚糖的粘液阿克曼氏菌，粪便及杆菌相对丰度显著升高，无法降解O-聚糖，但能利用多种膳食纤维的直肠真杆菌，卵圆形拟杆菌相对丰度显著降低，此外这四种差异微生物随着日粮的波动也快速变化，此外可以看到益生元日粮和纤维缺乏日粮微生物的变化是相似，但仍有一定差异。作者还测了屠宰小鼠的盲肠微生物16S rRNA和宏转录组数据，结果和粪便的结果相一致，，盲肠微生物数据表明，FR日粮中盲肠粘液降解菌的总相对丰度显著低于其他几种日粮模式。结肠激光捕获显微切割结果表明黏膜降解菌在结肠腔和黏液层均有增殖，是一个整体的效应，而不仅仅局限在黏液层。由此作者证明了不管是长期性的还是周期性的纤维缺乏都会导致粘液降解菌的富集。

作者在FF和Pre饮食中发现缺乏天然复杂植物纤维的黏液降解细菌升高，于是推断这种丰度的增加可能是由于它们能够降解黏液作为替代营养物质。为了验证这个观点，作者进一步测定了盲肠中微生物碳水化合物酶的活性。可以发现纤维富集日粮模式中，微生物膳食多糖酶家族基因高表，其中主要有卵圆形拟杆菌和直肠真杆菌贡献，这与作者前期的微生物生长试验结果相一致。而纤维缺乏日粮下，粘液降解菌粘蛋白靶向酶基因高表达，其中主要由粪便拟杆菌和粘液阿克曼氏菌贡献。其中编码M60样蛋白酶基因高表达，这是降解粘蛋白重要酶基因。进一步的作者为了研究这两个关键的粘液降解菌与粘液O-聚糖的联系，作者利用纯化的猪粘液O-聚糖进行生长试验检测微生物对聚糖的反应，然后再映射到自己的宏基因组数据中，再次证明粪便B.caccae, A.muciniphila O-聚糖降解能力增强。进一步的考虑到结肠O-聚糖和膳食多糖相比结构上存在一些差异，后者含有一些特有的糖苷键和硫酸键。作者从这个角度对盲肠微生物相关酶活进行了检测发现，相较于FR日粮，其他日粮形式微生物硫酸酯酶和a-盐藻糖苷酶含量显著升高；而FF日粮中降解膳食多糖的β-葡萄糖苷酶显著降低。进一步表明纤维缺乏使得粘液降解菌的粘蛋白讲解能力增强。总的来说，数据表明膳食纤维缺乏时，粘液降解菌协同表达各种粘液降解酶降解粘液多糖。

黏液层是一个动态的屏障，通过杯状细胞的分泌活动不断补充而维持稳定。那么粘液层是怎么变薄的呢？作者进一步推测，如果细菌对粘液的消耗量大于粘液的产量，导致屏障受损。为此作者对结肠组织进行了阿尔新蓝染色。结果表明FR日粮下，结肠黏液层最厚，是纤维缺乏日粮的5-6倍，同时粘液层厚度大于无菌小鼠组，表明黏液层的产生还需要微生物的刺激。盲肠转录组数据表明纤维缺乏日粮小鼠结肠粘蛋白MUC2基因表达轻微上调，这可能是宿主的一种代偿机制。一旦结肠黏液层变薄，肠道微生物就更接近肠上皮，这可能引发一些有害影响。于是作者进一步对宿主表型进行了研究，切片结果显示两组结肠没有明显的炎症迹象，体重上也没有显著差异。但是相较于纤维日粮组，FF组粪便中脂质转运蛋白浓度显著增加，结肠长度显著降低，此外盲肠转录组的数据也显示一些免疫相关通路和基因在FF组显著上调表明FF组小鼠确实发生了轻度的炎症。

单纯的纤维缺乏日粮和粘液解菌的存在只能导致轻度的结肠炎症。那么临床上相关结肠炎症到底是怎么产生的呢？黏液层是抵御共生微生物和病原体入侵的关键屏障，作者进一步合理假设在低纤维条件下，与微生物群活性相关的结肠厚度减少会增加病原体的易感性。于是作者进一步进行了鼠柠檬酸杆菌感染试验，该菌必须穿过黏液层抵达上皮才能引发结肠炎症。作者在51天分别屠宰两只确认两组结肠粘液层具有差异，56天开始进行感染试验，然后每天进行体重测定，收集粪便样品进行Cr浓度测定，16sRNA测序。为了控制饮食的影响，作者额外在没灌服SM的无菌鼠上做了感染。盲肠和结肠组织的组织学评分显示SM定殖FF饮食组的小鼠炎症覆盖的表面积明显更大。

到这里作者就证明了纤维缺乏的情况下，黏膜降解菌的增加，黏膜层的减少增加了病原菌的易感性。但是注意到前面没有SM定植的纤维缺乏的无菌小鼠感染组，它的黏液层也很薄，但炎症水平很低，作者推测这可能是由于感染后杯状细胞粘液分泌增加。于是作者进一步推测纤维缺乏日粮结肠组织更大的炎性面积可能是由于微生物降解的黏液层导致损伤进而使得病原体更早和更多地进入。为此作者进一步利用表达荧光素酶的Cr进行感染试验。

最后作者得出结论：膳食纤维和合成微生物群之间的代谢互作影响结肠粘膜层状态以及治病菌易感性：纤维多糖缺乏时，微生物选择吞噬结肠黏膜多糖，满足自生生长，结肠黏膜屏障功能失调，导致致病菌更易入侵，进而导致结肠炎症。

张凯同学最后对文章内容提出了思考：

1、组合微生物群等体积配是否合理？

2、作者主要想要研究结肠炎症，为什么文中屠宰数据测的是盲肠微生物及盲肠转录组？

3、文章大部分篇幅都在对比FF组和FR组，并没过多解析饮食波动组的数据，而这两种日粮可能更接近人类的饮食变化。